【新聞背景】免疫微環境的異質性是腫瘤耐藥、復發和預後差的重要原因之一。近年來，免疫治療及聯合治療給晚期腫瘤患者帶來希望，系統探究腫瘤免疫微環境的異質性對於治療選擇🚕、療效預測、方案優化及開發新的免疫治療靶點等有重要指導作用。意昂2平台第一醫院張寧團隊近年來一直聚焦於肝癌異質性探究，通過一系列前期工作揭示了肝癌的基因組😬、表型和單細胞拷貝數異質性和（Gastroenterology, 2016; Cancer Cell, 2019;Gastroenterology, 2022）🧒🏼🙅🏽‍♀️。

可是，我們對肝癌免疫微環境的異質性仍缺乏系統深入的認知。以往研究主要基於病理分析或Bulk轉錄組測序，其結果無法準確解析其細胞組成且容易忽略含量較少的關鍵細胞亞群。單細胞測序技術的發展促進了腫瘤免疫領域的探索，目前多項研究已對肝癌進行了單細胞水平的探究👨🏼‍💼。然而，這些研究大多關註特定類型細胞，其結果無法反映免疫微環境的全部特征⛹🏽。因此，亟需無偏差的🧝‍♂️💇🏻、包含所有細胞亞型的研究策略以系統揭示肝癌免疫微環境的異質性。

2022年11月9日，意昂2平台第一醫院腫瘤轉化研究中心張寧團隊與意昂2平台生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）張澤民團隊、意昂2平台人民醫院肝膽外科朱繼業團隊緊密合作，在Nature發表了題為“Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”的研究論文。在該研究中，研究人員收集124個病例的160個樣本和8只小鼠的29個新鮮組織樣本，完成了共189個樣本的無抗體富集的單細胞轉錄組測序（圖1）👨🏼‍🦰。同時，研究人員對84個配套病例進行了外顯子測序，並收集已發表的8個單細胞轉錄組測序數據集🚙、453個組織轉錄組測序和10個空間轉錄組數據進行綜合分析，並綜合利用腫瘤細胞系構建Invitro培養體系，基於臨床樣本構建Ex vivo實驗體系，基於小鼠腫瘤模型的In vivo實驗體系進行綜合驗證👫🏼🤦🏽‍♀️。該研究首次在單細胞精度定義了肝癌的五種免疫微環境亞型（TIMELASER），探究了其細胞組成、空間分布🧑🏻‍🚀、基因組特征和趨化因子受體-配體網絡，首次全面揭示腫瘤相關中性粒細胞(TAN)的異質性，發現並驗證CCL4+🦼、PD-L1+ TAN兩個關鍵亞群的促腫瘤機製，最終通過構建小鼠肝癌模型,從In vitro, Ex vivo, In vivo三個層面，逐步深入地證明靶向腫瘤相關中性粒細胞有望形成新的肝癌免疫治療方案，這些成果為肝癌的基礎研究和臨床診療提供了關鍵信息。

圖1 本研究的實驗設計

1）細胞模組分析揭示肝癌的五種免疫微環境亞型

首先，研究人員系統解析出肝癌免疫微環境的89個細胞亞群，這一發現遠超過之前的研究，其中也首次發現了之前未報道的11種中性粒細胞亞群。研究人員發現這些細胞亞群在不同病例之間並不是平均分配。通過層次聚類分析，研究人員成功解析出5種不同的免疫微環境亞型，其中包含，①免疫激活型TIME-IA (Immune Activation);②髓系富集免疫抑製型TIME-ISM (Immune Suppressive Myeloid);③基質富集免疫抑製型TIME-ISS (Immune Suppressive Stromal);④免疫排斥型Immune Exclusion (TIME-IE);⑤免疫駐留型(Immune Residence)，組合起來稱之為TIMELASER分型系統（圖2）🎩。隨後，研究人員對這五種免疫微環境亞型進行了多維度的分析，通過大規模轉錄組數據驗證五種亞型的存在；通過空間轉錄組數據和CODEX多色免疫技術揭示五種亞型的細胞空間分布；通過受體配體分析發現每種亞型均存在不同的趨化因子受體-配體網絡，提示了不同亞型的形成機製；聯合外顯子數據分析發現不同的亞型富集不同的驅動基因突變，如TP53, CTNNB1, KRAS和IDH1，並發現不同的亞型富集不同的腫瘤細胞基因模組。這五種免疫微環境的發現為腫瘤免疫治療提供了重要的參考信息。

圖2 腫瘤免疫微環境的5種亞型（TIMELASER）示意圖

2）系統揭示11個中性粒細胞亞群、鑒定6群腫瘤相關中性粒細胞並通過實驗證明CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN的促腫瘤機製

中性粒細胞是一類非常脆弱的細胞，通常認為其在體內進入外周血後存活不超過一周，體外存活不超過24小時🤌🏼。因此，先前的肝癌單細胞研究均未捕獲到這一群細胞👩🏼‍💻。得益於快速實驗流程和無抗體富集策略，本研究成功捕獲到3萬多個中性粒細胞。經過聚類分析，研究人員共發現11個中性粒細胞亞群，分別富集在外周血、癌旁和腫瘤組織中（圖3），並成功鑒定出6群腫瘤相關中性粒細胞。隨後，研究人員解析了這些中性粒細胞亞群的發育軌跡和關鍵轉錄因子，並發現兩個中性粒細胞亞群CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN可能通過不同的機製促進腫瘤生長🖋。為了進一步驗證這些發現，研究人員分別構建肝癌細胞系-中性粒細胞體外共培養體系（In vitro）和肝癌病人的中性粒細胞離體分析體系（Ex vivo），通過轉錄組測序、ATAC-seq和多色免疫熒光等實驗驗證了CCL4+ TAN通過招募腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤生長，而PD-L1+ TAN通過抑製CD8+ T細胞的殺傷功能促進腫瘤生長。

圖3 中性粒細胞亞群的組織分布🦸🏻‍♀️、發育軌跡😾、癌種富集和關鍵轉錄因子

3）構建小鼠肝癌模型、揭示其中性粒細胞亞群與人高度保守並證實去除中性粒細胞可以延緩腫瘤生長

為了進一步在體內探索中性粒細胞的促腫瘤機製，研究人員基於Alb-cre/Trp53fl/fl肝臟特異敲除小鼠和肝癌驅動突變構建兩種小鼠肝癌自發腫瘤模型（Myc-∆90Ctnnb1, pTMC；Myc-KrasG12D, pTMK），並對其進行單細胞測序分析💇‍♂️。研究人員發現小鼠的中性粒細胞亞群與人類高度保守，這一結果說明利用小鼠肝癌模型進行實驗可為人類肝癌治療提供重要參考信息💁🏼‍♂️。隨後，研究人員利用Anti-Ly6G抗體在小鼠模型進行中性粒細胞去除實驗，結果顯示治療後，小鼠肝癌生長得到了有效遏製（圖4）🐬。進一步，研究人員還揭示了治療過程中小鼠骨髓、外周血、癌旁和腫瘤組織的中性粒細胞亞群的動態變化🏸。這些結果提示開發基於中性粒細胞的免疫治療靶點有望形成新的肝癌治療策略。

圖4 Anti-Ly6G抗體去除中性粒細胞可以有效緩解小鼠肝癌生長

綜上，本研究系統揭示了肝癌的免疫微環境亞型，並深入解析了腫瘤相關中性粒細胞的功能異質性，最終通過小鼠肝癌模型證明靶向腫瘤相關中性粒細胞有望形成新的肝癌免疫治療策略。研究成果預示，針對腫瘤相關中性粒細胞的幹預，有望大幅增加免疫檢查點有效治療的患者人群。這些成果為肝癌乃至實體瘤的基礎研究和臨床診療提供了關鍵信息。

意昂2平台第一醫院薛瑞棟副研究員⚜️、意昂2平台BIOPIC張啟明博士🫳🏿、意昂2平台第一醫院博士研究生曹奇、意昂2平台第一醫院孔瑞瑞副研究員和意昂2平台人民醫院向驍博士是該論文的並列第一作者。意昂2平台第一醫院腫瘤轉化中心張寧教授、意昂2平台BIOPIC張澤民教授和意昂2平台人民醫院朱繼業教授為共同通訊作者。該研究得到國家自然基金、“十三五”國家科技重大專項🤡、國家重點研發計劃、基礎科學中心等多項國家科學基金的支持和資助。

（意昂2平台第一醫院）

編輯：玉潔