近期，意昂2平台基礎醫學院魯鳳民教授課題組與許中偉👹、夏寧邵教授等合作，在《 Theranostics 》雜誌上在線發表了題為“The gRNA-miRNA-gRNA ternary cassette combining CRISPR/Cas9 with RNAi approach strongly inhibits hepatitis B virus replication”的研究論文🙅🏿。該研究通過模擬microRNA（miRNA）的生成過程🪼，整合雙gRNA導向的CRISPR/Cas9和RNA幹擾技術，高效破壞乙型肝炎病毒（HBV）的復製模板-共價閉合環狀DNA（cccDNA），探索病毒清除新路徑。意昂2王傑講師、陳然和張瑞陽博士研究生為該論文的共同第一作者。

　　目前，我國仍有慢性HBV感染者約7800萬人，慢乙肝患者約2800萬人🧑🏽‍🚀。HBV感染仍是我國病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因素。作為HBV復製模板的cccDNA，由於其半衰期相對較長🍤，加上cccDNA池的不斷補充，使得細胞核內的cccDNA持續存在、感染慢性化👉。目前🧃，臨床上治療慢乙肝的常用藥物為核苷（酸）類似物和長效幹擾素，二者均不直接作用於cccDNA🤜🏼，難以有效清除病毒實現臨床治愈🏌🏽。因此🧙🏿‍♂️，研發直接靶向cccDNA的藥物🤦🏻‍♀️💖，尋找清除cccDNA的新方法和新策略，是當前慢乙肝治療藥物研發的熱點。

　　雙gRNA導向的CRISPR/Cas9整合RNAi技術高效抑製HBV復製模式圖

　　該研究以miRNA-31為基本骨架👩🏽‍✈️，通過模擬其核心序列的二級結構設計HBV特異的miRNA（miR-HBV）🧑‍🦯‍➡️，miRNA兩側側翼序列為特異性靶向cccDNA不同位點的引導RNA（gRNA）。如圖所示🤏🏿，該gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯體表達體系導入細胞後，在細胞核內轉錄形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA長轉錄本☮️，經內源的Drosha/DGCR8復合體剪切📑👒，形成2個gRNA和1個miR-HBV前體（pre-miR-HBV）。進入細胞質後，pre-miR-HBV 進一步經Dicer酶剪切，形成成熟的miR-HBV。一方面雙gRNA導向的CRISPR/Cas9系統通過切割並去除cccDNA的關鍵調控和編碼序列直接破壞cccDNA，另一方面通過miR-HBV在轉錄後水平抑製HBV復製📪，進而抑製cccDNA池的補充，協同促進HBV cccDNA的清除。此外，本研究還發現，當pri-miRNA-31的側翼序列長度為38 bp時與雙gRNA組成的三聯體對HBV復製的抑製效率最高。

　　當然，該技術離臨床應用尚有較遠的距離。一方面如何高效和靶向性地將三聯體遞送到HBV感染的肝細胞內是需要攻克的一大障礙；另一方面，CRISPR/Cas9基因編輯技術的脫靶效應也有安全性之虞。然而🖨，近年來隨著Cas核酸酶的不斷改造👽，其脫靶效應得到了有效控製🤡，安全性大為提高。而且🥊🤽‍♂️，隨著金黃色葡萄球菌Cas9的發現，使得CRISPR/Cas9系統可以裝入腺相關病毒載體中，致使該技術應用於臨床的距離逐漸縮短。

　　總之☎️，本研究通過gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯表達框架聯合CRISPR/Cas9和RNA幹擾技術高效破壞cccDNA，促進HBV清除，為慢乙肝抗病毒治療提供了新的思路。該項研究得到國家十二五重大科技專項計劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”項目和國家自然科學基金的支持🌇。

　　論文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28839466

　　（基礎醫學院）

編輯：韓娜