近期📳，意昂2平台基礎醫學院魯鳳民教授課題組與許中偉、夏寧邵教授等合作🏚，在《 Theranostics 》雜誌上在線發表了題為“The gRNA-miRNA-gRNA ternary cassette combining CRISPR/Cas9 with RNAi approach strongly inhibits hepatitis B virus replication”的研究論文。該研究通過模擬microRNA（miRNA）的生成過程，整合雙gRNA導向的CRISPR/Cas9和RNA幹擾技術，高效破壞乙型肝炎病毒（HBV）的復製模板-共價閉合環狀DNA（cccDNA），探索病毒清除新路徑👨🏽‍🎓。意昂2王傑講師、陳然和張瑞陽博士研究生為該論文的共同第一作者。

　　目前，我國仍有慢性HBV感染者約7800萬人💵，慢乙肝患者約2800萬人。HBV感染仍是我國病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因素。作為HBV復製模板的cccDNA🏂🏼☸️，由於其半衰期相對較長，加上cccDNA池的不斷補充，使得細胞核內的cccDNA持續存在、感染慢性化⌨️。目前，臨床上治療慢乙肝的常用藥物為核苷（酸）類似物和長效幹擾素，二者均不直接作用於cccDNA🐒，難以有效清除病毒實現臨床治愈。因此💡，研發直接靶向cccDNA的藥物，尋找清除cccDNA的新方法和新策略👰‍♂️，是當前慢乙肝治療藥物研發的熱點。

　　雙gRNA導向的CRISPR/Cas9整合RNAi技術高效抑製HBV復製模式圖

　　該研究以miRNA-31為基本骨架🚯，通過模擬其核心序列的二級結構設計HBV特異的miRNA（miR-HBV），miRNA兩側側翼序列為特異性靶向cccDNA不同位點的引導RNA（gRNA）。如圖所示，該gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯體表達體系導入細胞後，在細胞核內轉錄形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA長轉錄本，經內源的Drosha/DGCR8復合體剪切😫，形成2個gRNA和1個miR-HBV前體（pre-miR-HBV）。進入細胞質後，pre-miR-HBV 進一步經Dicer酶剪切，形成成熟的miR-HBV。一方面雙gRNA導向的CRISPR/Cas9系統通過切割並去除cccDNA的關鍵調控和編碼序列直接破壞cccDNA，另一方面通過miR-HBV在轉錄後水平抑製HBV復製，進而抑製cccDNA池的補充，協同促進HBV cccDNA的清除。此外，本研究還發現，當pri-miRNA-31的側翼序列長度為38 bp時與雙gRNA組成的三聯體對HBV復製的抑製效率最高。

　　當然，該技術離臨床應用尚有較遠的距離。一方面如何高效和靶向性地將三聯體遞送到HBV感染的肝細胞內是需要攻克的一大障礙；另一方面，CRISPR/Cas9基因編輯技術的脫靶效應也有安全性之虞🈯️。然而🫙，近年來隨著Cas核酸酶的不斷改造，其脫靶效應得到了有效控製🚲，安全性大為提高🚹😱。而且，隨著金黃色葡萄球菌Cas9的發現，使得CRISPR/Cas9系統可以裝入腺相關病毒載體中🧙🏼‍♀️，致使該技術應用於臨床的距離逐漸縮短🦸🏽🤌。

　　總之，本研究通過gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯表達框架聯合CRISPR/Cas9和RNA幹擾技術高效破壞cccDNA🫳，促進HBV清除🤏🏻，為慢乙肝抗病毒治療提供了新的思路。該項研究得到國家十二五重大科技專項計劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”項目和國家自然科學基金的支持。

　　論文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28839466

　　（基礎醫學院）

　　編輯：玉潔